NGS-Barcode-Count

适用于 DEL（DNA 编码库）、高通量 CRISPR 测序和条形码测序的快速且内存高效的 DNA 条形码计数器和解码器。包括错误处理和测序质量过滤器。适用于 DEL、高吞吐量 CRISPR 测序、条形码测序。如果包含条形码文件，程序将转换为条形码名称并纠正错误。如果包含随机条形码以压缩 PCR 重复，则不会计数这些重复。使用 8 个线程和约 2GB 的 RAM 使用量，解析超过 4 亿个测序读取仅需不到半小时。

对于 DEL 分析，创建了一个配套的 Python 包：DEL-Analysis

多线程和低资源使用。使用一个线程读取数据，其余线程处理数据，因此至少需要一个双线程机器。该程序不会在 RAM 中存储所有数据，而是顺序处理测序数据以保持内存高效。

错误处理默认为每个恒定区域和条形码的最大序列错误为 20%。这可以通过 CLI 参数进行更改。算法通过最佳匹配来修复任何测序的恒定区域或条形码。如果有两个或更多最佳匹配，则不计入。

还可以通过读取质量分数进行过滤。如果使用，则计算每个条形码的读取质量平均值，如果低于设置的阈值，则不计数读取。算法默认不进行过滤，除非调用 --min_quality 参数。请参阅 fastq 文档以了解读取质量分数。使用的分数是在进行 ASCII 转换和减去 33 后的结果。

灵感来自并采用了来自 decode 的某些想法

目录

• 安装
• 所需文件
• 运行
• 用法
• 测试结果

安装

本地安装 Rust：此处说明

curl --proto '=https' --tlsv1.2 -sSf https://sh.rustup.rs | sh

下载和编译 NGS-Barcode-Count

cargo install barcode-count

所需文件

目前支持 FASTQ、序列格式、样本条形码转换和构建块条形码转换。

• FASTQ
• 序列格式文件
• 样本条形码文件（可选）
• 计数条形码转换文件（可选）

Fastq 文件

接受未解压的 fastq 文件。
接受 gzipped fastq 文件，但如果程序在预期数量的测序读取之前停止，请解压并重新运行。

序列格式文件

序列格式文件应为一个按格式类型换行的文本文件。以下为支持的格式，其中'#'应替换为与条形码相对应的核苷酸数量：

示例文件可以在这里找到：scheme.example.txt。由于算法使用正则表达式搜索方案，方案可以存在于序列读数的任何位置。

样本条形码文件

可选
sample_barcode_file 是一个以逗号分隔的文件，格式如下：

示例文件可以在这里找到：sample_barcode.example.csv。

计数条形码转换文件

可选
barcode_file 是一个以逗号分隔的文件，格式如下：

示例文件可以在这里找到：barcode.example.csv。

其中第一列是DNA条形码，第二列是条形码ID，可以是DEL、CRISPR靶标ID等微笑字符串，但不能包含逗号。最后一列是条形码编号，作为整数。条形码编号与序列格式文件的顺序相同，从1开始。例如，如果有总共3个条形码，这种情况可能出现在DEL中，那么每一行中这个列将只有1、2或3，每个数字代表这三个条形码中的一个。对于CRISPR或条形码序列，其中可能只有一个条形码需要计数，这个列将全部为1。

运行

barcode-count --fastq <fastq_file> \
	--sample-barcodes <sample_barcodes_file> \
	--sequence-format <sequence_format_file> \
	--counted-barcodes <counted_barcodes_file> \
	--output-dir <output_dir> \
	--prefix <file_prefix> \
	--threads <num_of_threads> \
	--merge-output \
	--min-quality <min_barcode_read_quality>\
	--enrich

• --counted-barcodes 是可选的。如果不使用，输出计数将使用DNA条形码进行计数，不对这些条形码进行错误处理。
• --sample-barcodes 是可选的。如果不使用，如果包含在序列格式中，则使用DNA条形码。否则不使用标识符。
• --output-dir 如果不使用，默认为当前目录。
• --prefix 如果不使用，默认为当前日期。所有文件都以 _sample_name_counts.csv 结尾
• --threads 如果不使用，默认为机器上的线程数。
• --merge-output 标志用于合并输出csv文件，以便每个样本有一个列
• --min-quality 将过滤掉任何条形码的平均质量得分低于此处设置的阈值的读取。默认为0，不进行过滤。
• --enrich 参数标志将找到每个条形码的计数，如果有2个或更多计数条形码包含在内，并将文件输出。如果包含3个以上的双条形码，也会做同样的事情。这对于DEL很有用。

输出文件

每个样本名将得到一个文件，默认格式为 year-month-day_<sample_name>_counts.csv，以下格式（对于3个计数条形码）：

其中如果存在计数条形码转换文件，则使用条形码_ID，否则使用DNA代码。 # 表示计数数量

如果调用 --merge_output，则会创建一个额外的文件，格式如下（以3个样本为例）：

还会在输出文件夹中写入或追加一个额外的barcode_stats.txt文件。这可以跟踪运行信息。

如果调用 --enrich 参数，则输出单重和双重条形码计数文件。

用法

DEL

按照本README中使用的所有示例文件进行设置。通常，您会使用3个'[]'来计数条形码，这代表格式文件中的3个构建块。

CRISPR-seq

与DEL相同的设置，但在格式文件中通常只计算一个'[]'条形码。因此，在计数条形码转换文件中，第三列将包含所有'1'。

Barcode-seq

如果目的是计数随机条形码并将其计数与这些随机条形码关联起来，例如在细胞池的bar-seq和谱系进化等情况下，那么在这种情况下，随机条形码就是计数条形码，并在格式文件中以'[]'表示。不会包含计数条形码转换文件。没有计数条形码转换文件，程序将输出计数随机条形码序列及其关联计数。之后，可以进行聚类或其他分析。

测试结果

在8核心i7-4790K CPU @ 4.00GHz和16GB RAM的机器上，这个算法能在大约半小时内解码超过4亿个测序读数。

未解压的fastq

Total sequences:             418,770,347
Correctly matched sequences: 257,807,865
Constant region mismatches:  151,955,695
Sample barcode mismatches:   3,324,481
Counted barcode mismatches:  5,682,306
Duplicates:                  0
Low quality barcodes:        0

Compute time: 0 hours, 23 minutes, 43.439 seconds

-WRITING COUNTS-

Total time: 0 hours, 24 minutes, 11.016 seconds

gzip压缩的fastq

Total sequences:             418,770,348
Correctly matched sequences: 257,807,865
Constant region mismatches:  151,955,695
Sample barcode mismatches:   3,324,481
Counted barcode mismatches:  5,682,306
Duplicates:                  0
Low quality barcodes:        0

Compute time: 0 hours, 23 minutes, 20.122 seconds

-WRITING COUNTS-

Total time: 0 hours, 23 minutes, 47.645 seconds